Maka tugas kali ini menyajikan
Reviwu DNA Rekombinan dan Aplikasi Gen
Nama : BUSYRA
Nim :170104038
M.P : BIOTEKNOLOGI
REVIWU DNA REKOMBINAN DAN APLIKASI GEN
1. Enzim rektriksi bekerja untuk menghasilkan DNA rekobinan
Perkembangan teknologi DNA rekombinan sanat dimungkinkan karena penemuan enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokas-lokasi yang spesifik yang jumlahnya terbatas. Enzim-enzim tersebut dikenal sebagai enzim restriksi yang ditemukan pertama kali pada bakteri pada akhir tahun 1960-an. Kerja enzim tersebut dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan memotong DNA (termasuk DNA faga tertentu) yang asing bagi bakteri tersebut.
Maksud dari kegiatan memotong DNA asing tersebut tidak lain sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam molekul DNA dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME. Selanjutnya enzim tersebut akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil (CH3) pada adenine atau sitosin di dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi tersebut. Enzim-enzim restriksi yang telah ditemukan dan telah tersedia secara komersial telah berjumlah ratusan.
Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “sticky end”. Dengan memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu molekul DNA. Dalam praktikum ini akan dilakukan pemetaan restriksi sederhana pada plasmid pGemT dengan menggunakan beberapa jenis enzim restriksi.
2. Peran elektroforesis gel dalam bioteknologi
Elektroforesis gel dalam bioteknologi mempunyai peran yang sangat banyak dianataranya elektroforesis gel poliakrilamid yaitu elektroforesis merupakan proses berkerakannya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
3. Peran vector dalam kloning molekuler
Setiap fragmen DNA bisa digandakan setelah dimasukkan ke dalam vektor
yang cocok untuk transformasi bakteri sel host. Kloning mengacu pada produksi jumlah besar molekul DNA identik dan biasanya melibatkan penggunaan sel bakteri sebagai sel host untuk DNA, walaupun kloning dapat dilakukan dalam sel eukariotik juga. kloning cDNA mengacu pada produksi suatu perpustakaan DNA kloning (DNA library) yang mewakili semua mRNA dalam sel atau jaringan tertentu Kloning genom mengacu pada produksi suatu perpustakaan DNA kloning mewakili seluruh genom suatu organisme tertentu. Dari salah satu dari jenis DNA library dapat berasal dari isolat (dengan berbagai protokol skrining) suatu cDNA clone tunggal atau gen.
Dalam rangka untuk mengkloning baik cDNA atau salinan gen vektor diperlukan untuk membawa DNA kloning. Vektor yang digunakan dalam biologi molekul dari dua kelas dasar. Satu kelas vektor berasal dari plasmid bakteri, plasmid adalah DNA circuler ditemukan pada bakteri yang bereplikasi secara autosomal dari genom inang. DNA ini pertama kali diidentifikasi karena plasmid membawa gen resistensi antibiotik. Gen-gen resistensi antibiotic ditemukan pada plasmid digunakan dalam modern plasmid vitro direkayasa untuk memungkinkan pemilihan bakteri yang telah diambil plasmid yang berisi DNA yang menarik. Plasmid terbatas di dalam bentuk fragmen umum pasangan basa DNA kurang dari 10.000 (pb)
dapat digandakan. Dalam fragmen praktek sekitar 5.000 bp adalah batas.
Jenis lain dari vektor berasal dari bakteriofag (virus bakteri) lambda. Virus ini mampu baik lysogeny (integrasi ke dalam genom inang) dan lisis (infeksi diikuti oleh lisis dari host yang terinfeksi). Gen yang diperlukan untuk lysogeny telah dihapus dari vektor lambda yang berbasis di untuk memungkinkan hanya siklus hidup litik untuk mengambil tempat.
Keuntungan untuk vektor lambda berbasis adalah bahwa mereka dapat membawa fragmen DNA hingga 25.000 bp. Dalam analisis genom manusia bahkan vektor lambda berbasis membatasi dan kromosom ragi buatan (YAC) sistem vektor telah dikembangkan untuk kloning DNA fragmen sampai dengan 500.000 bp.
Penentuan sekuen atau fragmen DNA melalui sekuensing bertujuan untuk memastikan fragmen DNA yang diisolasi adalah gen target sesuai dengan kehendak kita. Suatu fragmen DNA yang mengandung gen target yang akan diklon, selanjutnya diinsersikan/dimasukkan ke dalam molekul DNA sirkular yang disebut vector (plasmid, phage atau cosmid) untuk menghasilkan chimoera atau molekul DNA rekombinan. Vektor bertindak sebagai wahana atau wadah, yang membawa gen masuk ke dalam sel inang atau tuan rumah (host).). DNA rekombinan yang dihasilkan kemudian ditransformasi ke dalam sel inang (biasanya sel bakteri, misalnya strain E. coli walaupun sel walaupun sel--sel jenis sel jenis lain dapat di gunakan) untuk diproduksi lebih banyak.
4. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR adalah teknik yang kuat digunakan untuk memperkuat DNA jutaan kali lipat, dengan replikasi berulang template, dalam waktu singkat. Proses ini menggunakan set tertentu dalam vitro oligonukleotida sintesis untuk sintesis DNA prima. Desain primer tergantung pada urutan DNA yang diinginkan untuk dianalisis.
Teknik ini dilakukan melalui banyak siklus (biasanya 20-50) pencairan template pada suhu tinggi, yang memungkinkan primer untuk anil untuk urutan gratis dalam template dan kemudian mereplikasi template dengan DNA polimerase. Proses ini telah otomatis dengan menggunakan DNA polimerase termostabil diisolasi dari bakteri yang tumbuh di ventilasi termal di laut atau air panas. Selama putaran pertama replikasi satu salinan DNA dikonversi menjadi dua salinan dan seterusnya mengakibatkan peningkatan eksponensial jumlah salinan dari urutan yang ditargetkan oleh primer. Setelah hanya 20 siklus satu salinan DNA diperkuat lebih dari 2.000.000 kali lipat.
Produk dari reaksi PCR dianalisis dengan pemisahan dalam gel agarosa diikuti oleh bromida pewarnaan dan visualisasi dengan transillumination ultraviolet. Atau, dNTP radioaktif dapat ditambahkan untuk PCR dalam rangka untuk menggabungkan label ke dalam produk.
Dalam hal ini produk dari PCR yang divisualisasikan oleh paparan gel untuk film x-ray. Keuntungan menggunakan radiolabeling pada produk PCR adalah dapat meningkatkan kuantitas tingkat produk amplifikasi Reaksi berantai polimerase dapat digunakan untuk memperkuat baik ganda dan beruntai tunggal (misalnya produk dari reaksi transkripsi terbalik, RT-PCR) DNA. Template dicampur dengan primer spesifik atau merosot, dNTP, buffer polymerase termasuk DNA polimerase MgCl2 dan termostabil. Template adalah didenaturasi pada suhu tinggi (misalnya 95° C) dan kemudian didinginkan ke suhu yang optimal akan memungkinkan primer mengikat. Suhu reaksi kemudian dinaikkan menjadi optimal bahwa untuk DNA polimerase (misalnya 72° C) dimana primer diperluas sepanjang template. Rangkaian langkah ini dilakukan 20-30 kali mengarah ke amplifikasi eksponensial dari template target. Amplifikasi ini begitu besar bahwa produk reaksi dapat divisualisasikan berikut elektroforesis gel.
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah salah satu jenis eksperimen yang sudah sangat umum dilakukan dalam ranah biologi molekuler. Berdasar pada kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis untai DNA baru dari template yang tersedia, PCR banyak digunakan dalam analisis molekuler terutama untuk memperbanyak region (amplikon) yang diinginkan hingga mendeteksi adanya gen tertentu pada suatu sampel. Ada 3 tahapan proses PCR yang harus dilalui oleh sebuah sampel DNA. 3 prosesnya adalah seperti berikut ini.
Tahap Proses PCR
Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase.
a. Denaturasi
Ini adalah proses PCR yang melakukan pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 ˚C – 95 ˚C.
b. Penempelan primer
Proses selanjutnya adalah penempelan primer. Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 ˚C – 60 ˚C. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 ˚C.
c. Reaksi polimerisasi (extension)
Pada tahap PCR bernama extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA dari sampel, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurang dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya. Adapun temperatur ekstensi berkisar antara 70-72°C. Salah satu jenis metode PCR adalah Real-time PCR.
No comments:
Post a Comment